De técnicas histológicas




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Tipos de fijadores


-De acuerdo a su acción sobre las proteínas (Coagulantes y No coagulantes)

-De acuerdo a su origen general (Físicos y Químicos)

Ambas clasificaciones utilizan las mismas sustancias, la diferencia está en que la primera explica el mecanismo de acción del fijador (que será ampliada durante la sesión teórica del tema). La segunda clasificación es la más utilizada desde el punto de vista práctico, por lo que es la que será tratada en esta recopilación.

Fijadores Físicos.


Calor: Tiene utilidad en Microbiología y Bacteriología donde tiene excelentes resultados. No es de uso rutinario en Histología


Frío: Es muy utilizado cuando se requiere mantener en buenas condiciones y en su lugar, las diversas sustancias intracelulares, especialmente para técnicas de histoquímica o inmunohistoquímica. Las diversas formas de fijación por frío serán tratadas en la sesión teórica del tema

Fijadores Químicos.


Simples: Son sustancias químicas de estructura no compleja, que se mezclan con agua destilada para lograr la proporción adecuada. Ejemplos:

•Ac. Acético

•Alcohol etílico C2H5OH

•Formaldehido H-CHO

•Ac. Pícrico

•Ac. Crómico

•Dicromato de potasio K2Cr2O7

•Bicloruro de Mercurio HgCl2

•Tetraóxido de osmio OsO4

•Glutaraldehido

•Permanganato de potasio KMnO4


Compuestos o Mezclas fijadoras: Se originan por la combinación de varios de los fijadores químicos simples, y tienen usos particulares para los cuales fueron creados. Ejemplos:

•Formol tamponado

•Formol calcio

•Líquido de Zenker

•Líquido de Bouin

•Líquido de Helly

•Fijador de Carnoy

•Líquido de Flemming

•Zenker-formalina


ANEXOS:

A. Preparación del fijador Formol tamponado al 10%.


Utiliza Formol puro, el cual va a ser disuelto al 10% en Buffer Fosfato. Esto le da mejores resultados a la fijación, ya que acerca el pH del fijador al de los tejidos.

Preparación del Buffer Fosfato (0.1M, pH 6,3):


1. Se preparan dos soluciones denominadas A y B


Solución A:

Fosfato monobásico de sodio (NaHPO4) --------------------------- 13,8 gr.

Agua destilada --------------------------------------------------------- 1000 cc


Solución B:


Fosfato monobásico de sodio (Na2HPO4) --------------------------- 35,8 gr.

Agua destilada --------------------------------------------------------- 1000 cc


2. Para preparar 100 cc del Buffer fosfato, se mezclan:

22.5 cc de la solución A, y

77.5 cc de la solución B


3.


Finalmente, se mezclan 10 cc de formol puro con 90 cc del buffer fosfato para la obtención de 100 cc de formol tamponado.


Proceso de fijación por perfusión cardíaca de rata:

Materiales a utilizar

1.Dos recipientes de suero, uno con fijador, y el otro con solución fisiológica


2.Dos equipos de infusión con su soporte

3.Equipo de disección

4.Cánula para perfusión

5.Soporte de madera e hilo pabilo para la inmovilización

6.Papel absorbente, inyectadoras, anestésicos, guantes


Procedimiento:

1.Anestesia del espécimen con pentotal sódico (40mg./Kg.) o Ketamina (100mg./Kg.) por vía intraperitoneal. También puede ser utilizado éter o cloroformo por inhalación en campana de vidrio

2.Fijar el espécimen a un soporte que sostenga todas sus extremidades

3.Hacer incisión medial de la piel para exponer la caja toráxica

4.Realizar dos incisiones a la parrilla costal en las líneas axilares anteriores y levantar la parrilla costal

5.Exponer el corazón y localizar el ventrículo izquierdo

6.Hacer una pequeña incisión con el bisturí en dicho ventrículo e introducir la cánula hasta llegar a la arteria aorta ascendente. Ligar la cánula a la aorta en forma cuidadosa

7.Comenzar a pasar la solución fisiológica (isotérmica al espécimen) a través de la cánula para extraer por completo la sangre del animal, esto con la finalidad de evitar vasoconstricción. Simultaneo a este paso, se debe hacer una pequeña incisión en el ventrículo derecho del animal, para que drene el liquido que está siendo introducido

8.Cuando se observe que la solución fisiológica ya está drenando por el ventrículo derecho, es el momento de iniciar la perfusión con el líquido fijador, en este caso, formol tamponado al 10% durante 30-40 minutos aproximadamente

9.En el momento en que el fijador penetra en el torrente circulatorio, se observa que el animal comienza a presentar fibrilaciones musculares, lo que indica que el fijador esta pasando en forma adecuada.

10.Luego de agotado el tiempo, se desmonta el espécimen y se aprecia que tiene la apariencia de piel tipo suela, lo que indica una fijación satisfactoria en principio

11.Se hace la disección de los órganos a utilizar, se hacen los cortes en piezas del tamaño respectivo, y se colocan de inmediato en líquido fijador (por inmersión) para seguir luego con los siguientes pasos de la técnica.


Anexos:


Anatomía torácica del ratón de laboratorio



Es importante tomar en cuenta que el ventrículo izquierdo (resaltado en negro) es posterior, por lo que la incisión y la canulación deben ser cuidadosamente realizadas, para el éxito de la técnica.



Tomado de : Greene EC. Anatomy of the rat. Philadelphia: Hafner Publishing Company. 1963


Fotografía de la fijación por perfusión cardíaca



Tomado de : Cook M. The Anatomy of the laboratory mouse. London: Academic press inc. 1965


SESIÓN III


MÉTODOS DE DESHIDRATACIÓN, ACLARACIÓN E INCLUSIÓN EN PARAFINA.

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